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Ionenchromatographie als überlegene Methode
Die am weitesten verbreiteten Analysetechniken zur Bestimmung von Kohlenhydraten sind
die Magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie (1H-NMR), Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR),
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), sowie Gas- und Flüssigkeitschromatographie (GC/IC) mit
anschliessender Massenspektronomie (MS). Während spektrometrische Methoden teure Geräte und hoch
qualifiziertes Personal voraussetzen, erfordern gaschromatographische Methoden eine zeitaufwändige
Derivatisierung. Als Alternative empfliehlt sich die
Hochleistungs-Anionen-Austauschchromatographie, die günstiger als die Massenspektrometrie und
schneller als gaschromatographische Methoden ist.
Methodische Herausforderungen
In stark alkalischen mobilen Phasen werden die anionischen Bestandteile des Zuckers auf einem
positiv geladenen Anionenaustauscher getrennt. Geringfügige Unterschiede in den pK a Werten der
Kohlenhydrat-Hydroxyl-Geräten ermöglichen die Auftrennung von niedermolekularen Sachhariden. Die
Schwierigkeit besteht darin, eine Methode zu finden, welche eine einfache und ausreichend
empfindliche Detektion der getrennten Kohlenhydrate erlaubt. UV- und Fluoreszenz-Detektion scheiden
aus, weil weder Chromophoren noch Fluorophoren vorliegen. Der Refraktionsindex-Detektor wiederum
ist mit dem Nachteil behaftet, dass er nicht empfindlich genug ist und Gradientenelution nicht
möglich ist.
Amperometrische Detektion als vielseitig einsetzbare Methode
Da Kohlenhydrate elektrochemisch aktiv sind, lassen sich die oben genannten Schwierigkeiten
mittels amperometrischer Detektion überwinden. Hierzu wird ein Verfahren angewendet, das als
gepulste amperometrische Detektion (PAD) bekannt ist. Zunächst wird eine positive Spannung (E1)
angelegt, um die Target-Analyten zu bestimmen gefolgt von einem zweiten, stärker positiven Impuls
(E2), durch welchen die Reaktionsprodukte mittels Oxydation von der Elektrode entfernt werden. Ein
dritter, negativer Spannungsimpuls (E3) dient schliesslich dazu, Oxide auf der Elektrodenoberfläche
zu reduzieren. Der gesamte, dreistufige Prozess dauert in der Regel eine Sekunde und wiederholt
sich im Sekundentakt, um eine Beschädigung der Elektrode zu verhindern. Neben Kohlenhydraten eignet
sich PAD auch zur Bestimmung von Aminozuckern, Aminosäuren, biogenen Aminen, schwefelhaftigen
Spezies, Alkoholen und diversen Antibiotika.
Metrohm empfiehlt für diese Applikationen den
871 Advanced Bioscan.
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